霍乱弧菌能够引起人群霍乱的暴发流行，已导致了七次全球大流行，目前仍处在第七次大流行中。霍乱流行有明显的季节性，在一些四季分明的地区，往往冬季时流行消失、而第二年气温升高后，又出现流行。因此，霍乱弧菌如何适应低温和“越冬”，是霍乱防治和微生物学研究中重要的话题。
在霍乱的监测中，当气温降低时，很难从环境水体中分离到霍乱弧菌，而在气温水温升高时，又可分离到。早期研究发现霍乱弧菌在低温中能够形成“活的非可培养状态”（Viable But Non-culturable State，VBNC状态），即细菌培养不到、但仍然是存活的状态，这是霍乱弧菌应对恶劣环境的呈现一种休眠方式的适应性改变。当前对这种细胞的状态做了不少研究，但其发生发展、复苏机理一直不清楚。另外由于自环境样本中培养不到，会给霍乱的环境监测和疫情预警、溯源带来困扰。
重点实验室霍乱组对霍乱弧VBNC状态及其发展机理开展了研究，近期发现霍乱弧菌的一个全局性调控因子与VBNC状态发展有关联，在霍乱弧菌抗低温、延缓VBNC状态发展中发挥重要作用，研究内容以Quorum Sensing Regulation Confronts the Development of a Viable but Non-Culturable State in Vibrio cholerae为题发表在微生物学研究期刊Environmental Microbiology上。
图1. 课题组发表的文章。
为研究霍乱弧菌VBNC发展调节机理，课题组建立了多孔细胞板培养霍乱弧菌VBNC状态的培养基和环境条件、以及定量评测VBNC细胞的方法，然后利用转座子随机突变策略，对约一万株转座子突变株进行VBNC状态培养监测，发现一株突变株与野生株相比、明显推迟了进入VBNC状态的时间，显示为异常抗低温的菌株。鉴定发现转座子插入到RNA聚合酶的σ54因子基因（rpoN）中。σ54因子调节多种基因表达，前期有研究观察到霍乱弧菌自诱导子及密度感应系统（quorum sensing, QS）可诱导霍乱弧菌VBNC复苏的现象，而QS系统中核心调节子HapR也受σ54因子调节，因此课题组尝试分析hapR的可能作用。
研究发现hapR在霍乱弧菌VBNC状态发展起始阶段，即出现了逆转性的、高水平的转录上调，这更提示了其作用，随后又进一步缺失hapR基因、以及缺失其上游调控通路的luxO、rpoN、四个小RNA基因 qrrs1-4，发现缺失这些能抑制hapR转录的上游基因均导致菌株延迟进入VBNC状态，缺失hapR本身则使菌株快速进入VBNC状态。因此，hapR转录和表达的变化，影响到霍乱弧菌进入VBNC状态。
图2.本项研究首先鉴定到σ54因子、随后关联到QS主调控子HapR对霍乱弧菌VBNC状态发展和抵抗低温低营养环
境发挥作用。图中标识了研究涉及的影响VBNC状态发展的QS通路中一些调控子（红色字体显示的调控因子）。
课题组早先研究发现流行的霍乱菌株中，有些菌株QS功能是正常的，有些是失活的，而有些则是组成性的持续表达。本项研究中，按不同流行时间挑选了这三类菌株，测定hapR基因启动子启始转录表达强度，发现QS失活菌株均很低、而组成性表达菌株均很高。在进入VBNC状态的时间上，与QS正常菌株相比，也是QS失活菌株明显提前进入VBNC状态，而QS组成性表达菌株延迟进入VBNC状态，这在自然分离菌株上也证明了hapR对VBNC发展的调节作用。若在不利环境下仍保持鲜活状态，则在不同克隆群的生长竞争中可能会具有优先生长的优势。为此，研究中选择了hapR缺失株和小RNA qrrs1-4缺失株两个菌株、分别代表了hapR失活和增强状态、与野生株进行了在低温低营养中的竞争生存实验，也发现hapR基因转录增强的菌株在不利环境下具有最强的保持鲜活状态的能力和数量优势。
图4. 具有不同QS功能的霍乱弧菌自然分离株中，HapR组成性表达的菌株具有更强的耐低温、保持鲜活的可培养
能力。
这项研究从调控通路上将霍乱弧菌VBNC状态发展与密度感应系统联系了起来，为霍乱弧菌VBNC状态形成和影响机制、以及霍乱弧菌环境适应方面提供了新认识。发现QS组成性表达、能赋予霍乱弧菌耐低温和低营养，也部分解释了为什么能分离到一些QS组成性表达的菌株。另外，也提示有可能从利用自诱导子和诱导QS主调控子HapR的功能这一途径寻找霍乱弧菌VBNC细菌的复苏办法，以提高从低温和低营养环境样本中分离霍乱弧菌的概率，为霍乱的监测预警提供帮助。
本文作者中，霍乱组博士研究生吴斌为第一作者，阚飙研究员为通讯作者。本研究受到973课题（2015CB554201）、传染病预防控制国家重点实验室课题（2014SKLID101）、以及国家自然科学基金课题（31700035）的支持。
